日前，贵州理工学院食品药品制造工程学院韩铭海副教授课题组在Journalof Biotechnology上发表了题为《一种基于Cre/loxP系统敲除毕赤酵母基因的方法》（“A modified method of gene disruption inKomagataella phaffiiwith Cre/loxP system”）的研究论文。

毕赤酵母（Komagataella phaffii）是当今商业化生产重组蛋白类产品最常用的宿主之一。这种蛋白表达宿主具有诸多优点：细胞培养密度高、高效而可控的启动子、蛋白翻译后修饰、异源蛋白高效分泌表达、胞外蛋白易于分离和纯化以及公认的安全性等，是当今最受欢迎的蛋白表达平台之一。然而，诸多具有良好商业化应用价值的蛋白仍不能得到高水平的表达，这迫切需要进一步优化改进毕赤酵母蛋白分泌机能。

在2009年，毕赤酵母全基因组测序已完成并公布。在后基因组学研究中，基因操纵是工程改造毕赤酵母最常用的策略，其中基因敲除又是经常使用的技术之一。常规的基因敲除方法需要使用抗生素抗性标记或营养缺陷型标记，而可选择标记是很有限的，这使得删除同一生物体中的多个基因相当困难，阻碍了基础和应用研究的步伐。

而Cre/loxP系统介导的重组提供了筛选标记重复使用的可能性。CRE重组酶催化两个loxP位点之间的重组，不需要任何宿主辅因子或辅助蛋白质。如果位于线性DNA分子上的两个loxP（lox71和lox66）处于同一方向，CRE可以删除它们之间的DNA序列，只留下一个重组的新的loxP（lox72）序列，而新引入的lox72位点是不参与Cre/loxP介导的重组，从而实现永久切除lox71和lox66之间的DNA片段。

在本论文的研究中，课题组设计了一个结构简单的基因敲除盒，它只包含Sh ble基因（Zeocin^TM抗性基因）和两侧的loxP位点和同源臂（loxP之间只有大约1400bp），而且通过常用的方法就可以构建这个基因敲除盒，不涉及复杂的操作，比如其他类似文献报道的融合PCR技术。而且在该方法中，可实现lox71-Sh ble-lox66序列的模块化，这为敲除多个基因构建多个基因敲除盒的操作提供了便利。